发布日期：2024-11-04 06:26 点击次数：120
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Y190感受态细胞居品融会
基因型
MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, cyhr2, LYS2 : : GAL1
UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ
● 居品融会
Y190 菌株是 Clontech 公司成就的 GAL4 系统酵母双杂推行用菌株，MATa 型，可胜利滚动质粒或与 MATα 型酵母菌株 Y187通过 mating 操作进行卵白互作考证或筛库熟谙。Transformation marker 为：trp1，leu2，cyh2；讲述基因为：lacZ，HIS3，MEL1。Y190-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：(pGB 和 pACT2)或（pGBKT7 和 pGADT7）。质粒 pGB 由 pGBKT7改良而来，筛选记号为 TRP1，用于抒发 DNA-BD(来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~ 174 位氨基酸)与看法卵白(Bait)的交融卵白；质粒 ACT2 与 pGADT7 的结构和功能近似，筛选记号为 LEU，用于抒发 AD(GAL4 C 端 768~881 位氨基酸)与看法卵白(Prey)的交融卵白。GAL4 系统旨趣：一个竣工的酵母转录因子 AL4 可分为功能上相互孤立的两个结构域：位于 N 端 1~174位氨基酸区段的 DNA 协调域 (DNA-BD)和位于 C 端 768~881 位氨基酸区段的转录激活域(AD)。DNA-BD 或者识别 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并与之协调。而 AD 不错脱手 UAS 下流的基因进行转录。BD 和 AD 单独存在不成激活转录，但当二者接近时，则呈现竣工的 GAL4 活性，使含有 UAS 的脱手子下流基因转录抒发。平素条款下，BD 不与 AD 协调，将要检测的卵白质鉴别与 BD 和 AD 交融，造成 bait 交融卵白(bait –BD)和 prey 交融卵白 (prey-AD)，要是 bait 和 prey发生相互作用，就会促使 BD 和 AD 的相互接近，造成竣工的 GAL4，从而激活讲述基因的转录。Y190 感受态细胞经独特工艺制作，-80℃可保存三个月，pGADT7 质粒检测滚动收场>104 cfu/μg DNA。
● 操作设施
1. Carrier DNA 在每次使用前要通过加热处治使其变性为单链景色，智商如下：Carrier DNA 放 95℃水浴或金属浴 3 min，快速插入冰中，静置 3 min，再次放 95℃水浴或金属浴 3 min，快速插入冰中，静置 3 min 以上。
2. 取 100 µl 冰上溶解的 Y190 感受态细胞，按序加入预冷的看法质粒 0.5-3 µg，Carrier DNA10 µl，PEG/LiAc 500 µl 并吸打几次混匀，30℃水浴 30 min (15 min 时翻转 6-8 次混匀)。
3. 将管放 42℃水浴 15 min (7.5 min 时翻转 6-8 次混匀)。
4. 5000 rpm 离心 40 s 弃上清，ddH2O 400 µl 重悬，离心 30s 弃上清。
5. ddH2O 50 µl 重悬天天影视播放器，涂板，29℃培养 48-96 h。